|
|
Identifikace RNA elementů u hub
PÍCHALOVÁ, Barbora
V současné době se do popředí zájmu výzkumu dostávají interakce mezi houbami, mykoviry a životním prostředím. Říše Fungi zahrnuje ekologicky a ekonomicky významné druhy hub, které mohou působit jako patogeny či symbionti, nebo se mohou vyskytovat v půdě jako mykorhizní a endofytní houby. Navzdory jejich ekologickému, biomedicínskému a průmyslovému významu stále chybí fylogenetické studie celé řady hub a jejich virů. Pro pochopení základních vztahů mezi mykoviry a jejich houbovými hostiteli je zásadní studium biologických vlastností, distribuce a přenosu nejen samotných virů, ale také hub. Tato studie si klade za cíl identifikovat jednotlivé druhy hub a zjistit, zda se v nich nachází mykoviry. Pro výzkum diverzity byly využity vzorky hub sbíraných na území České republiky během roku 2020 a 2021. K jejich detekci a identifikaci byly zvoleny molekulárně genetické metody. DNA z hub byla izolována pomocí CTAB-PVP, úsek DNA byl amplifikován pomocí sekvence oblasti ITS, translačního elongačního faktoru TEF1-alfa genu a genu beta-tubulinu. Na základě sekvencí byl pro vzorky vytvořen fylogenetický strom podle genetické podobnosti mezi jednotlivými rody. Pro detekci mykovirů byla využita metoda izolace dsRNA pomocí fenol-chloroformu a celulózy a vzorky byly vyhodnoceny pomocí agarózové elektroforézy.
|
|
|
Recognition of expressed double-stranded RNAs in mammalian cells
Vaškovičová, Michaela ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Dlhá dvojvláknová RNA je unikátnou štruktúrou, ktorá vzniká počas vírovej replikácie, alebo počas transkripcie repetitívnych sekvencií. Cicavčie bunky si preto vyvinuli niekoľko mechanizmov ako reagovať na dvojvláknovú RNA: interferonovú odpoveď, RNA editáciu, a RNA interferenciu. RNA interferencia je evolučne konzervovanou dráhou, ktorá vedie k sekvenčne-špecifickej degradácii cieľovej mediátorovej RNA. V cicavčích bunkách je však RNA interferencia aktívna iba v myších oocytoch, ktoré exprimujú skrátenú verziu proteínu Dicer, zatiaľ čo v somatických bunkách spúšťa dvojvláknová RNA sekvenčne-nezávislú interferonovú odpoveď. Hlavným cieľom moje diplomovej práce bolo zistiť, akým spôsobom ovplyvňujú proteíny viažuce dvojvláknovú RNA smerovanie dvojvláknovej RNA buď do dráhy RNA interferencie alebo do sekvenčne-nezávislých dráh. Na monitorovanie sekvenčne-špecifických a sekvenčne-nešpecifických efektov dvojvláknovej RNA ko-exprimovanej s proteínmi viažucimi dvojvláknovú RNA sme použili luciferázovú reportérovú esej. Naše výsledky ukazujú, že žiadny z testovaných proteínov nie je schopný stimulovať RNA interferenciu v somatických bunkách. Nadmerná expresia proteínu TRBP2 alebo proteínu PACT prekvapivo potlačuje RNA interferenciu v bunkách produkujúcich skrátenú verziu proteínu Dicer. A čo viac,...
|
|
|
Substrate cleavage by mammalian Dicer isoforms
Kubíková, Jana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent)
Hostitelské organismy vyvinuly řadu antivirových odpovědí, které rozpoznávají a potlačují virovou infekci. Jedním ze znaků virové infekce je i přítomnost dvouvláknové RNA v buňce. Jedna z drah odpovídajících na dvouvláknovou RNA je RNA interference, která představuje klíčovou složku antivirové obrany u bezobratlých živočichů a rostlin. Savci využívají pro obranu před viry odlišnou dráhu, která rozpoznává dvouvláknovou RNA, nazývající se interferonová odpověd. RNA interference funguje jen v savčích oocytech a raných embryonálních stádiích, ačkoliv potřebné enzymové vybavení se nachází ve všech somatických buňkách, protože je využíváno mikroRNA dráhou. Předchozí studie ukázala, že funkčnost RNA interference v myších oocytech souvisí s přítomností oocytární isoformy Diceru (DicerO ), jež je zkrácená na N-konci. V této práci jsem se zaměřila na zhodnocení, zda DicerO zpracovává substráty typické pro RNA interferenci účinněji než nezkrácená isoforma Diceru (DicerS ), která se nachází v somatických buňkách. Za tímto účelem jsem vyvinula protokol na purifikaci Diceru, abych získala obě myší isoformy Diceru o vysoké čistotě. Následně jsem otestovala jejich aktivitu v neradioaktivní enzymové analýze na různých substrátech se strukturními prvky charakteristickými pro substráty RNA interference. Získané výsledky...
|
|
|
RNA interference in mouse oocytes and somatic cells
Táborská, Eliška ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; O´Connell, Mary Anne (oponent) ; Petr, Jaroslav (oponent)
RNA interference (RNAi) je dráha, ve které Dicer štěpí dlouhé dvouvláknové RNA endogenního a exogenního původu na krátké interferující RNA (siRNA). Tyto siRNA jsou předány Argonaut proteinům, které jsou efektory sekvenčně specifického post-transkripčního umlčování RNA. RNAi reguluje protein-kodující geny a retrotranspozony nebo zprostředkuje protivirovou imunitní odpověď. Další dráha malých RNA - dráha RNA associovaných s PIWI proteiny (piRNA dráha) umlčuje retrotranspozony v zárodečné linii. Aktivita kanonické RNAi dráhy je v myších somatických buňkách nevýznamná. Dlouhá varianta Diceru zde produkuje mikroRNA (miRNA) které regulují (protein-kodující) geny. RNAi je naopak vysoce aktivní v oocytech, které produkují zkrácenou oocyt-specifickou isoformu Diceru (DicerO ). DicerO nemá N-koncovou DExD helikázovou doménu a má zvýšenou schopnost štěpit dlouhé dvouvláknové RNA. Delece oocyt-specifického promotoru DicerO vede ke globální deregulaci transkriptomu včetně zvýšené exprese domnělých cílových molekul RNAi a MT retrotranspozonů. V důsledkem je defect meiotického vřeténka a neplodnost samic. Oproti tomu piRNA dráha je pro myší oocyty neesenciální, pravděpodobně kvůli překrývající se funkci s RNAi. Tato doktorská práce má za cíl porozumět biologickému významu savčí endogenní RNAi and prozkoumat...
|
|
|
Porovnání metod izolací dvouvláknové RNA z rostlinného pletiva se zaměřením na výtěžnost virové frakce
MATYÁŠOVÁ, Alena
Pro diagnostiku rostlinných patogenů lze využít masivně paralelní sekvenování (HTS), které má výhodu v sekvenčně nespecifickém zachycení sekvencí všech přítomných organismů ve vzorku. Vstupní materiál lze připravit více metodami podle účelu použití. Cílem této práce je porovnat kvalitativní a kvantitativní profil dvou metod pro izolaci RNA z rostlinného pletiva s obohacením o dvouvláknové frakce za účelem zvýšení množství virových RNA vůči RNA hostitelské rostliny. Srovnávanými metodami jsou běžně využívaná afinní celulózní chromatografie a diferenciální centrifugace s LiCl. Jako výzkumný soubor byla použita rostlina jetele lučního (Trifolium pratense L.) infikovaná viry s jednovláknovými a dvouvláknovými RNA genomy. Tyto viry byly v rostlině v minulosti detekovány pomocí HTS. Testovanými metodami byly z rostliny extrahovány ribonukleové kyseliny. Pomocí metody RT-PCR byly amplifikovány specifické fragmenty osmi virů a po vyhodnocení gelové elektroforézy byl porovnán kvalitativní profil obou metod. Pro porovnání kvantitativního profilu byly vybrány tři viry s různými druhy RNA genomů. Metodou RT-qPCR byla provedena jejich relativní kvantifikace. S využitím softwaru Bio-rad CFX Manager 3.1 byla vyhodnocena normalizovaná exprese jednotlivých virů k 26S ribozomální RNA jako referenční kontrole. Pomocí obou porovnávaných metod byla detekována přítomnost všech testovaných virů. Po vyhodnocení kvantifikačních dat a provedení statistických testů (F-test, T-test) s hladinou významnosti = 0,05 bylo shledáno, že mezi metodou afinní celulózní chromatografie a metodou s diferenciální centrifugací s LiCl není signifikantní rozdíl.
|
|
|
Substrate cleavage by mammalian Dicer isoforms
Kubíková, Jana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent)
Hostitelské organismy vyvinuly řadu antivirových odpovědí, které rozpoznávají a potlačují virovou infekci. Jedním ze znaků virové infekce je i přítomnost dvouvláknové RNA v buňce. Jedna z drah odpovídajících na dvouvláknovou RNA je RNA interference, která představuje klíčovou složku antivirové obrany u bezobratlých živočichů a rostlin. Savci využívají pro obranu před viry odlišnou dráhu, která rozpoznává dvouvláknovou RNA, nazývající se interferonová odpověd. RNA interference funguje jen v savčích oocytech a raných embryonálních stádiích, ačkoliv potřebné enzymové vybavení se nachází ve všech somatických buňkách, protože je využíváno mikroRNA dráhou. Předchozí studie ukázala, že funkčnost RNA interference v myších oocytech souvisí s přítomností oocytární isoformy Diceru (DicerO ), jež je zkrácená na N-konci. V této práci jsem se zaměřila na zhodnocení, zda DicerO zpracovává substráty typické pro RNA interferenci účinněji než nezkrácená isoforma Diceru (DicerS ), která se nachází v somatických buňkách. Za tímto účelem jsem vyvinula protokol na purifikaci Diceru, abych získala obě myší isoformy Diceru o vysoké čistotě. Následně jsem otestovala jejich aktivitu v neradioaktivní enzymové analýze na různých substrátech se strukturními prvky charakteristickými pro substráty RNA interference. Získané výsledky...
|
|
|
Recognition of expressed double-stranded RNAs in mammalian cells
Vaškovičová, Michaela ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Dlhá dvojvláknová RNA je unikátnou štruktúrou, ktorá vzniká počas vírovej replikácie, alebo počas transkripcie repetitívnych sekvencií. Cicavčie bunky si preto vyvinuli niekoľko mechanizmov ako reagovať na dvojvláknovú RNA: interferonovú odpoveď, RNA editáciu, a RNA interferenciu. RNA interferencia je evolučne konzervovanou dráhou, ktorá vedie k sekvenčne-špecifickej degradácii cieľovej mediátorovej RNA. V cicavčích bunkách je však RNA interferencia aktívna iba v myších oocytoch, ktoré exprimujú skrátenú verziu proteínu Dicer, zatiaľ čo v somatických bunkách spúšťa dvojvláknová RNA sekvenčne-nezávislú interferonovú odpoveď. Hlavným cieľom moje diplomovej práce bolo zistiť, akým spôsobom ovplyvňujú proteíny viažuce dvojvláknovú RNA smerovanie dvojvláknovej RNA buď do dráhy RNA interferencie alebo do sekvenčne-nezávislých dráh. Na monitorovanie sekvenčne-špecifických a sekvenčne-nešpecifických efektov dvojvláknovej RNA ko-exprimovanej s proteínmi viažucimi dvojvláknovú RNA sme použili luciferázovú reportérovú esej. Naše výsledky ukazujú, že žiadny z testovaných proteínov nie je schopný stimulovať RNA interferenciu v somatických bunkách. Nadmerná expresia proteínu TRBP2 alebo proteínu PACT prekvapivo potlačuje RNA interferenciu v bunkách produkujúcich skrátenú verziu proteínu Dicer. A čo viac,...
|
|
|
Studium diversity a rozšíření virů entomopatogenní houby \nl{}\kur{Beauveria bassiana} v České republice
VANĚČEK, Petr
Mykoviry jsou viry, které infikují houbové buňky, kde se i replikují, ale na rozdíl od většiny známých virů rostlin a živočichů mají jen výjimečně škodlivý vliv na jejich hostitele. Nicméně, poslední objevy ukazují, že některé mykoviry mohou snížit virulenci jejich fytopatogenních hostitelů, což dělá mykoviry velmi atraktivními z důvodu jejich možného využití v biologické ochraně. Většina mykovirů má dsRNA genomy a jsou rozšířené ve všech hlavních taxonech hub. Beauveria bassiana je jednou z nejvíce studovaných entomopatogenních hub. Má kosmopolitní rozšíření a v zemědělství je využívána v rámci biologické ochrany rostlin proti bezobratlým škůdcům. V této práci byla analyzována sbírka 137 vzorků B. bassiana získaných z odlišných lokalit a přírodních stanovišť v České republice. Tyto izoláty byly testovány na přítomnost dsRNA fragmentů indikujících virovou infekci. Výsledky odhalily vysoký výskyt virové infekce mezi českými izoláty B. bassiana, bylo detekováno 22,6% vzorků obsahujících dsRNA fragmenty s virovými charakteristikami. Získané elektroforeotypy dsRNA ukazují, že virová rozmanitost u infikovaných izolátů byla vysoká, a že se mezi izoláty objevily smíšené virové infekce. Na základě charakteristik elektroforetických profilů může být předpokládáno, že izoláty B. bassiana nasbírané v České republice mohly být infikovány zástupci virových čeledí Totiviridae, Partitiviridae, Chrysoviridae a Hypoviridae.
|
|
|
Occurrence of putative dsRNA mycoviruses in Ash Dieback Causal Agent
Čermáková, Vendula
Invazní organismy se staly velkou hrozbou pro diverzitu a fungování ekosystémů jak v Evropě, tak i jinde a to především díky enviromentálním změnám, globalizaci a zvětšující se vzdálenosti transportu rostlin v rámci obchodu s nimi. V posledních 20 letech si evropské jasany (Fraxinus excelsior L., Fraxinus angustifolia Vahl., etc.) prošly vážným chřadnutím a odumíráním díky introdukci a šíření patogenní houby Hymenoscyphus pseudoalbidus Queloz (syn. Chalara fraxinea Kowalski). Jakmile se tato choroba v porostu rozšíří, je budoucí ekonomické využití téměř nemožné. V posledních osmi letech je tedy velkou prioritou vědeckých pracovníků po celé Evropě najít možnosti jakékoli účinné kontroly. Objevení mykovirů, které zmírňují patogenitu významného houbového škůdce rakoviny kůry kaštanovníku (Cryphonecria parasitka (Murr.) Barr.) započalo intenzivní výzkum možného využití mykovirů pro biologickou kontrolu houbových chorob. V této práci je zkoumán výskyt dsRNA u výše zmíněné patogenní houby H. pseudoalbidus, jakožto významný indikátor přítomnosti mykovirů.Na začátku experimentu bylo získáno 106 vzorků tohoto škůdce z osmi různých evropských zemí. Podle testů přítomnosti dsRNA byly molekuly dsRNA zjištěny u 32,1 % zkoumaných vzorků (dva segmenty dsRNA o velikosti přibližně 2--2,5 kb a jeden o velikosti 5 kb). Statistické výsledky neodhalily žádný významný vztah mezi přítomností dsRNA a rychlostí růstu mycelia, zbarvením mycelia ani jinými vlastnostmi.
|
host ::
RSS.